1. Objectif : Cette procédure vise à fournir une procédure standardisée pour les opérations aseptiques et la protection des salles stériles.
2. Champ d'application : laboratoire d'essais biologiques
3. Responsable : Superviseur du contrôle qualité
4. Définition : Aucune
5. Précautions de sécurité
Effectuer les opérations de manière strictement aseptique afin de prévenir toute contamination microbienne ; les opérateurs doivent éteindre la lampe UV avant d'entrer dans la salle stérile.
6. Procédures
6.1. La salle stérile doit être équipée d'une salle d'opération stérile et d'une salle tampon. La salle d'opération stérile doit être de classe 10 000. La température ambiante doit être maintenue entre 20 et 24 °C et l'humidité relative entre 45 et 60 %. La hotte à flux laminaire doit être de classe 100.
6.2. La salle stérile doit être maintenue propre et il est strictement interdit d'y accumuler des débris afin d'éviter toute contamination.
6.3. Prévenir strictement toute contamination du matériel de stérilisation et des milieux de culture. Les personnes qui les utilisent doivent cesser immédiatement de les utiliser.
6.4. La salle stérile doit être équipée de désinfectants à concentration de travail, tels que la solution de crésol à 5 %, l'alcool à 70 %, la solution de chlorméthionine à 0,1 %, etc.
6.5. La salle stérile doit être régulièrement stérilisée et nettoyée avec un désinfectant approprié afin de garantir que la propreté de la salle stérile réponde aux exigences.
6.6. Tous les instruments, ustensiles, plats et autres articles qui doivent être introduits dans la salle stérile doivent être emballés hermétiquement et stérilisés par des méthodes appropriées.
6.7. Avant d'entrer dans la salle stérile, le personnel doit se laver les mains avec du savon ou un désinfectant, puis revêtir une tenue de travail spéciale, des chaussures, une charlotte, un masque et des gants dans la salle tampon (ou se désinfecter à nouveau les mains avec de l'éthanol à 70 %). Les interventions chirurgicales doivent être réalisées dans une enceinte bactériologique.
6.8. Avant toute utilisation en salle stérile, la lampe à ultraviolets doit être allumée pour l'irradiation et la stérilisation pendant plus de 30 minutes, et la hotte à flux laminaire doit être mise en marche simultanément pour la ventilation. Après l'intervention, la salle stérile doit être nettoyée puis stérilisée aux ultraviolets pendant 20 minutes.
6.9. Avant l'inspection, l'emballage extérieur de l'échantillon doit rester intact et ne doit pas être ouvert afin d'éviter toute contamination. Avant l'inspection, désinfecter la surface extérieure à l'aide de cotons imbibés d'alcool à 70 %.
6.10. Lors de chaque opération, un contrôle négatif doit être effectué pour vérifier la fiabilité de l'opération aseptique.
6.11. Lors de l'absorption de liquide bactérien, utilisez une ventouse. Ne mettez pas la paille directement avec la bouche.
6.12. L’aiguille d’inoculation doit être stérilisée à la flamme avant et après chaque utilisation. Après refroidissement, la culture peut être inoculée.
6.13. Les pailles, les tubes à essai, les boîtes de Petri et autres ustensiles contenant du liquide bactérien doivent être trempés dans un seau de stérilisation contenant une solution de Lysol à 5 % pour désinfection, puis retirés et rincés après 24 heures.
6.14. En cas de projection de liquide contaminé sur une table ou le sol, arrosez immédiatement la zone contaminée avec une solution d'acide phénique à 5 % ou de Lysol à 3 % pendant au moins 30 minutes avant de procéder au traitement. Si les vêtements et les chapeaux de travail sont contaminés par un liquide contaminé, retirez-les immédiatement et lavez-les après stérilisation à la vapeur haute pression.
6.15. Tout objet contenant des bactéries vivantes doit être désinfecté avant d'être rincé sous l'eau courante. Il est strictement interdit de polluer les égouts.
6.16. Le nombre de colonies en salle stérile doit être contrôlé mensuellement. Sous hotte à flux laminaire, prélever plusieurs boîtes de Petri stériles de 90 mm de diamètre intérieur et y injecter aseptiquement environ 15 ml de milieu de culture gélosé nutritif préalablement fondu et refroidi à environ 45 °C. Après solidification, les placer à l'envers dans un incubateur à 30-35 °C pendant 48 heures. Après vérification de la stérilité, prélever 3 à 5 boîtes et les placer à gauche, au centre et à droite du poste de travail. Après avoir ouvert le couvercle et les avoir exposées pendant 30 minutes, les placer à l'envers dans un incubateur à 30-35 °C pendant 48 heures, puis les examiner. Le nombre moyen de bactéries diverses par boîte de Petri en salle blanche de classe 100 ne doit pas dépasser 1 colonie, et le nombre moyen en salle blanche de classe 10 000 ne doit pas dépasser 3 colonies. Si la limite est dépassée, la salle stérile doit être désinfectée en profondeur jusqu'à ce que des inspections répétées satisfassent aux exigences.
7. Reportez-vous au chapitre (Méthode d'inspection de la stérilité) dans « Méthodes d'inspection hygiénique des médicaments » et « Pratiques opérationnelles normalisées chinoises pour l'inspection des médicaments ».
8. Service de distribution : Service de gestion de la qualité
Instructions techniques pour salles blanches :
Après avoir obtenu un environnement et du matériel stériles, il est impératif de maintenir cet état de stérilité pour étudier un micro-organisme spécifique connu ou exploiter ses fonctions. Autrement, divers micro-organismes extérieurs peuvent facilement s'y introduire. Ce phénomène d'introduction de micro-organismes non pertinents est appelé contamination bactérienne en microbiologie. La prévention de la contamination est une technique essentielle en microbiologie. La stérilisation complète et la prévention de la contamination sont deux aspects fondamentaux de l'asepsie. De plus, il est crucial d'empêcher la dissémination des micro-organismes étudiés, notamment les micro-organismes pathogènes ou génétiquement modifiés qui n'existent pas à l'état naturel, hors des récipients expérimentaux. À cette fin, la microbiologie dispose de nombreuses mesures.
La salle stérile est généralement une petite pièce spécialement aménagée dans un laboratoire de microbiologie. Elle peut être construite en plaques de verre et en verre. Sa superficie ne doit pas être trop importante, environ 4 à 5 mètres carrés, et sa hauteur sous plafond d'environ 2,5 mètres. Une salle tampon doit être installée à l'extérieur de la salle stérile. Les portes de la salle tampon et de la salle stérile ne doivent pas être orientées dans la même direction afin d'éviter toute contamination bactérienne par l'air. La salle stérile et la salle tampon doivent être parfaitement étanches. Le système de ventilation intérieur doit être équipé de dispositifs de filtration d'air. Le sol et les murs de la salle stérile doivent être lisses, faciles à nettoyer et ne pas retenir la saleté. Le plan de travail doit être de niveau. La salle stérile et la salle tampon sont équipées de lampes à ultraviolets. Dans la salle stérile, les lampes sont placées à 1 mètre du plan de travail. Le personnel entrant dans la salle stérile doit porter une tenue et une charlotte stériles.
Actuellement, les salles stériles sont principalement utilisées dans les usines de microbiologie, tandis que les laboratoires généraux utilisent des enceintes à flux laminaire. La fonction principale de ces enceintes est d'éliminer les poussières fines, y compris les micro-organismes, présentes sur les surfaces de travail grâce à un système de flux d'air laminaire. Ce système permet à l'air de traverser un filtre HEPA avant d'atteindre la surface de travail, assurant ainsi un flux d'air stérile constant. De plus, un rideau d'air à haute vitesse, situé côté extérieur, empêche toute contamination bactérienne.
Dans les environnements difficiles, des boîtes stériles en bois peuvent remplacer les postes de travail à flux laminaire. De structure simple et facile à déplacer, ces boîtes sont munies de deux ouvertures sur leur face avant, obturées par des portes à ouverture par pression lorsqu'elles ne sont pas utilisées. L'accès à l'intérieur est libre pendant la manipulation. La partie supérieure de la face avant est vitrée pour faciliter l'observation de l'intérieur. Une lampe à ultraviolets est intégrée à la boîte, et les instruments et bactéries peuvent y être introduits par une petite porte latérale.
Les techniques opératoires aseptiques jouent actuellement un rôle essentiel non seulement dans la recherche et les applications microbiologiques, mais sont également largement utilisées dans de nombreuses biotechnologies, comme par exemple la technologie transgénique et la technologie des anticorps monoclonaux.
Date de publication : 6 mars 2024